如今，流式細(xì)胞分析在實(shí)驗(yàn)室中是越來(lái)越常見(jiàn)。然而，設(shè)計(jì)一個(gè)多色的分析卻讓人很頭疼。在此，Bio-Rad的流式專家教你10個(gè)技巧，能幫助你設(shè)計(jì)出一個(gè)成功的多色流式分析實(shí)驗(yàn)。

1. 熟悉你的流式細(xì)胞儀

了解你所用的流式細(xì)胞儀的性能，這非常重要。大多數(shù)流式細(xì)胞儀有兩個(gè)或多個(gè)激光器，有五種波長(zhǎng)可供選擇：紫外（355 nm）、紫色（405 nm）、藍(lán)色（488 nm）、黃色（561 nm）和紅色（640 nm）。除了激光器，具體的濾光片和檢測(cè)器也決定了你的配置。這些明確了可同時(shí)檢測(cè)多少種顏色（新的儀器可能超過(guò)17種）。熒光微球的定期清洗和校準(zhǔn)將讓你更好地利用流式細(xì)胞儀。

2. 恰當(dāng)?shù)刂苽淠愕臉悠?/p>

制備方法不當(dāng)或不健康的細(xì)胞可能導(dǎo)致結(jié)果不佳，因?yàn)榧?xì)胞死亡或結(jié)塊。在制備細(xì)胞時(shí)，你應(yīng)當(dāng)溫柔地對(duì)待它們，避免劇烈的渦旋振蕩。在染色時(shí)，如果實(shí)驗(yàn)允許，細(xì)胞應(yīng)放在冰上。細(xì)胞團(tuán)塊會(huì)阻塞流式細(xì)胞儀，為了減少團(tuán)塊的形成，應(yīng)避免高的細(xì)胞密度。加入DNase I或EDTA，也是個(gè)好辦法。

3. 去除死細(xì)胞

死細(xì)胞可能帶來(lái)假陽(yáng)性的結(jié)果，因?yàn)樽园l(fā)熒光以及非特異的抗體結(jié)合增加。通過(guò)前向散射（FSC）和側(cè)向散射（SSC）設(shè)門不一定能排除死細(xì)胞，因此是使用活細(xì)胞/死細(xì)胞的染料。人們通常用碘化丙啶（PI）或7-AAD來(lái)鑒定死細(xì)胞，但這不適用于固定細(xì)胞。現(xiàn)在Bio-Rad還提供一種VivaFix™活細(xì)胞/死細(xì)胞染料，適用于活細(xì)胞或固定細(xì)胞。

4. 優(yōu)化你的染色操作

抗體的非特異結(jié)合可能導(dǎo)致假陽(yáng)性。通過(guò)添加BSA來(lái)封閉這些相互作用，可以減少這種非特異的結(jié)合。此外，許多細(xì)胞（如B細(xì)胞、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）在細(xì)胞表面有Fcg受體，可與抗體的Fc區(qū)域結(jié)合，造成非特異的染色。這些可通過(guò)添加FcR封閉試劑或使用F(ab)2片段來(lái)避免。高的抗體濃度也會(huì)增加非特異的結(jié)合。因此，抗體濃度應(yīng)準(zhǔn)確測(cè)定，以便提高信噪比。使用適當(dāng)?shù)目贵w濃度是多色流式分析的關(guān)鍵。

5. 是否使用同型對(duì)照

你可能不想使用同型對(duì)照。但是，這樣做的前提是你有了其他適當(dāng)?shù)膶?duì)照。同型對(duì)照與你的抗體有著相同的亞型、相同的熒光基團(tuán)，來(lái)自相同的供應(yīng)商，在相同濃度下使用。它的目的是確保觀察到的染色是由于特異性的抗體結(jié)合，從而排除Fcg受體的非特異結(jié)合，并排除抗體或熒光基團(tuán)的非特異結(jié)合。