實(shí)驗(yàn)原理

  由于RNA的來(lái)源和種類很多，因此提取方法各異，一般有苯酚法、去污劑法、和鹽酸胍法。其中苯酚法是實(shí)驗(yàn)室zui常用的。組織勻漿用苯酚處理并離心后，RNA即溶于上層被苯酚飽和的水相中。DNA和蛋白質(zhì)則留在酚層中。向水層加入乙醇后，RNA即以白色絮狀沉淀析出，此法能較好地除去DNA及蛋白質(zhì)，提取的RNA具有生物活性。

  工業(yè)上制備RNA多選用成本低，適于大規(guī)模操作的稀堿法及濃鹽酸。用發(fā)酵工業(yè)的下腳料如酵母、白地酶如青霉菌菌絲體登提取RNA，其得率常為菌種重量的3%~5%。而DNA含量?jī)H為0.03%~0.52%，因此提取RNA多以酵母為原料。稀堿法是用氫氧化鈉溶液，使細(xì)菌細(xì)胞壁變性，濃鹽法是用高濃度鹽溶液處理，同時(shí)加熱，以改變細(xì)胞壁的通透性，使核酸從細(xì)胞內(nèi)釋放出來(lái)。用稀堿法使酵母細(xì)胞裂解后，用酸中和，然后除去菌體，使乙醇沉淀上清液中的RNA或?qū)H值調(diào)至RNA的等電點(diǎn)，是蛋白質(zhì)沉淀出來(lái)。

  RNA是生物高分子化合物，進(jìn)一步水解可生成磷酸、戊糖和堿基。各種組分可用于下述方法鑒定：

  1.磷酸于鉬酸銨試劑作用能產(chǎn)生黃色的磷鉬酸銨沉淀。

  2.核糖與地衣酚試劑反應(yīng)呈鮮綠色。

  3.嘌呤堿與硝酸銀產(chǎn)生白色的嘌呤銀化合物沉淀。

實(shí)驗(yàn)方法

  1.酵母RNA提?。?/p>

  （1）稱4g干酵母粉置于100ml燒杯中，加入40ml0.2%氫氧化鈉溶液，沸水浴上加熱30分鐘，不斷攪拌。

  （2）加入數(shù)滴乙酸溶液使提取液呈酸性，4000r/min，離心10~15分鐘。

  （3）取上清液，加入30ml 95%乙醇洗2次，每次用10ml。

  （4）用無(wú)水乙醇洗兩次，每次10ml，洗滌時(shí)可用小玻棒小心攪動(dòng)沉淀。

  （5）用布氏漏斗抽濾，沉淀在空氣中干燥。

  （6）稱量所得RNA樣品重量，計(jì)算得率。

  2.RNA組分鑒定：

  （1）水解RNA：像錐形瓶中加入少量（0.1~0.2g）酵母RNA個(gè)10%硫酸溶液15ml，在瓶口上插一玻璃小漏斗，漏斗上蓋上表面皿，然后在沸水浴中加熱水解約30分鐘，過(guò)濾，取濾液進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)。

  （2）嘌呤堿基的檢查：取試管一支，加入1ml 0.1mol/L硝酸銀溶液，再逐滴加1mol/L氨水至沉淀消失。然后加入1ml濾液，放置片刻，觀察有無(wú)嘌呤堿基的銀化合物沉淀產(chǎn)生。

  （3）磷酸的檢查：取2ml濾液放入1支試管中，加入5滴硝酸銀和1ml鉬酸銨溶液后，在沸水中加熱，觀察有無(wú)黃色磷鉬酸銨沉淀產(chǎn)生。

  （4）戊糖的檢查：取一支試管，加入1ml濾液，然后加入2ml地衣酚試劑，搖勻后在沸水浴上加熱10~15分鐘，觀察顏色的變化。  

注意事項(xiàng)

  1.稀堿法提取的RNA為變性RNA，可用于RNA組分鑒定及單核苷酸制備，不能作為RNA生物活性實(shí)驗(yàn)材料。

  2.脫氧核糖及核糖均可與地衣酚反應(yīng)。因此地衣酚試驗(yàn)不能作為RNA與DNA鑒定的依據(jù)。