細(xì)胞組分的分離與純化

研究人員對(duì)細(xì)胞組分進(jìn)行分級(jí)分離的原因有很多。他們可能希望，當(dāng)感興趣的蛋白在某些條件下或某種處理之后轉(zhuǎn)位時(shí)，對(duì)其進(jìn)行追蹤；或者是獲得有活性的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)構(gòu)建無(wú)細(xì)胞體系，從而在體外對(duì)一些復(fù)雜的生物學(xué)過程進(jìn)行模擬研究；抑或是分離相當(dāng)純度的亞細(xì)胞器用于電泳或色譜分析，從而建立相應(yīng)的亞細(xì)胞器蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)。細(xì)胞組分的分離與純化分為傳統(tǒng)的離心分離純化法，以及親和純化-免疫磁珠分離純化法，具體如下。

1、離心分離純化法

離心方法，包括差速離心法和密度梯度離心法，密度梯度離心法又分為速度-區(qū)帶密度梯度離心法和等密度梯度離心法。

在選用合理的方法對(duì)細(xì)胞或組織進(jìn)行破碎后，首先要進(jìn)行差速離心法，即根據(jù)不同離心速度所產(chǎn)生的不同離心力將各種細(xì)胞組分和顆粒分離開來(lái)。各種細(xì)胞器和顆粒典型的差速離心順序見下表。

經(jīng)過多次復(fù)雜的差速離心也可純化各種亞細(xì)胞器，但常常是事倍功半，很大的離心工作量，卻得到不太高的純度。此時(shí)，可以將差速離心得到的沉淀物再進(jìn)行密度梯度離心進(jìn)一步純化。

在速度區(qū)帶離心中，由于不同組分顆粒在梯度液中沉降速率的差別，而在離心的某一時(shí)刻形成了數(shù)個(gè)含有單一組分顆粒的區(qū)帶。

樣品在離心后與梯度液一起收集，用常規(guī)技術(shù)去除梯度液后就得到了某個(gè)較純的成分。每個(gè)單一組分的沉降速率取決于它們的形狀、尺寸、密度、離心力的大小、梯度液的密度和粘性系數(shù)。

與速度區(qū)帶離心法不同，等密度梯度離心是根據(jù)細(xì)胞組分顆粒的不同密度來(lái)進(jìn)行離心分離的，即根據(jù)組分顆粒的浮力。

細(xì)胞組分沉淀可以鋪在梯度液之上，也可置于梯度液之下，甚至和梯度液混在一起。在離心過程中由于組分顆粒各單一成分向各自的等密度區(qū)靠攏即達(dá)到了分離純化的目的。

根據(jù)以往文獻(xiàn)報(bào)道，分離純化各種細(xì)胞組分顆粒推薦使用的密度梯度介質(zhì)和離心條件如下表。

綜上所述，離心法分離純化細(xì)胞組分可以一次性對(duì)大量的細(xì)胞或組織粗提液進(jìn)行分離純化，并將其富集濃縮成較小的體積以適應(yīng)后續(xù)的分析研究。

但也存在一定的局限性，具體表現(xiàn)在：*，差速離心法貼壁效應(yīng)嚴(yán)重，常在離心管的一側(cè)出現(xiàn)沉淀，導(dǎo)致顆粒被擠壓變形而失活；第二，無(wú)法將具有相似密度、大小的不同細(xì)胞器分離開來(lái)，例如微粒體和過氧化物酶體等；第三，對(duì)于異質(zhì)型細(xì)胞器（即具有不同密度、大小的同一類變異細(xì)胞器）無(wú)法兼顧，只能選擇收集某一密度范圍的，對(duì)于其他密度的只能丟棄；第四，離心所需要的超速離心機(jī)及相匹配的轉(zhuǎn)子對(duì)于一些小型的實(shí)驗(yàn)室來(lái)說可能并不容易達(dá)到。

細(xì)胞組分的分離與純化

2、親和-免疫磁珠純化分離法

免疫磁珠或稱免疫磁性微球，具有超順磁性，可通過抗體與靶細(xì)胞器特異性結(jié)合并使之具有磁響應(yīng)性。將免疫磁珠與待分離的混合物共同孵育，免疫磁珠就可通過抗原抗體反應(yīng)選擇性地與靶細(xì)胞器物質(zhì)結(jié)合，當(dāng)此復(fù)合物通過一個(gè)磁場(chǎng)裝置時(shí)，與免疫磁珠結(jié)合的靶細(xì)胞器就會(huì)被磁場(chǎng)滯留，從而與其他復(fù)雜物質(zhì)分離開來(lái)。

用于細(xì)胞組分分離的免疫磁性微球必須具備以下條件：

1）化學(xué)性能穩(wěn)定，不產(chǎn)生凝聚；

2）不與細(xì)胞發(fā)生非特異性的結(jié)合；

3）磁性微球與抗體的結(jié)合牢固；

4）磁性微球的大小均勻，磁響應(yīng)性好，磁性納米材料的含量均勻一致；

5）磁性微球大小適當(dāng)，對(duì)于較小的細(xì)胞器宜選擇較大的磁珠，以確保兩者之間的相互作用更牢固。

對(duì)于免疫分離技術(shù)來(lái)說，特異性抗體的選擇非常關(guān)鍵?？贵w必須能夠特異性識(shí)別并且能夠到達(dá)位于靶細(xì)胞器上的抗原表位。

如果抗原表位被包埋在細(xì)胞器的內(nèi)部，則與磁珠相結(jié)合的抗體可能就很難達(dá)到。據(jù)此，免疫分離可以分為直接和間接兩種方法。

若抗原表位位于靶細(xì)胞器的表面，通常采用直接法，即將特異性抗體直接與磁珠或包被有二抗的磁珠相結(jié)合，然后再加入待分離的細(xì)胞粗提物進(jìn)行親和純化。

直接法的分離速度和效率相對(duì)來(lái)說較好。但若抗原表位被包埋在內(nèi)部，則更適合使用間接法。即特意習(xí)慣抗體先與待純化的細(xì)胞粗提物混合，然后再加入包被有二抗的磁珠，將抗體-靶細(xì)胞器復(fù)合物進(jìn)行免疫分離。

當(dāng)磁珠-靶細(xì)胞器復(fù)合物形成后，只需要將小管放在磁鐵上，在幾秒鐘內(nèi)復(fù)合物被吸到靠近磁鐵的管壁上，然后將上清吸掉即可，而不需要進(jìn)行離心或過柱，如此輕柔的操作，足以保持亞細(xì)胞器的生物學(xué)活性。

免疫磁珠分離技術(shù)很好的彌補(bǔ)了離心分離法的四點(diǎn)缺陷，但也有其不足之處，即一次分離純化所得到的樣品的體積較小，需要的特異性抗體的量較大。

如果特異性抗原表位被包埋在內(nèi)部，盡管在分離過程中可采用間接法，但zui終的分離效率可能會(huì)降低。并且那些未與靶細(xì)胞器相結(jié)合的抗體必須借助密度梯度離心或其他的一些手段去除。

因此，如果將傳統(tǒng)的離心法與免疫磁珠法相結(jié)合就可以很好的解決各種問題。即對(duì)組織或細(xì)胞粗提液先進(jìn)行差速離心，然后將相應(yīng)的沉淀或上清進(jìn)行進(jìn)一步的密度梯度離心。

將收集的比較富集的組分合并，用于免疫磁珠的分離。這樣就可以獲得具有一定數(shù)量的相當(dāng)純度的細(xì)胞器組分顆粒，以便后面的其他分析操作。

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