Annexin V-FITCPI凋亡檢測試劑盒使用原理

磷脂酰絲氨酸（PS）是?種帶負(fù)電荷的磷脂，正常細(xì)胞中，PS只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，?在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜PS由脂膜內(nèi)側(cè)翻向細(xì)胞膜外側(cè)，使PS暴露在細(xì)胞膜外表?。Annexin V是?種分?量為35~36kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋?，與磷脂酰絲氨酸有?度親和?，故可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V被*為檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之?。

操作說明

1. 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：

a) 懸浮細(xì)胞：

1）收集細(xì)胞?離?管中1000-2000rpm離心5min，小心去除上清。

2）用1ml 4℃預(yù)冷PBS輕輕重懸細(xì)胞并計數(shù)，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。

3）再加?1ml 4℃預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。

b) 貼壁細(xì)胞：

1）吸出細(xì)胞培養(yǎng)液至離?管中，PBS洗滌貼壁細(xì)胞?次，加?適量不含EDTA的胰酶細(xì)胞消化液消化細(xì)胞。

2）室溫孵育?輕輕吹打可以使貼壁細(xì)胞吹打下來時，吸除胰酶細(xì)胞消化液。需避免胰酶的過度消化。

3）加?以上步驟中收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，稍混勻，轉(zhuǎn)移到離?管內(nèi)，1000-2000rpm離?5min，??吸除上清。

注：加?的細(xì)胞培養(yǎng)液一方面可以收集已經(jīng)懸浮的發(fā)?凋亡或壞死的細(xì)胞，另一方面細(xì)胞培養(yǎng)液中的?清可以有效抑制或中和殘留的胰酶；殘留的胰酶會消化并降解后續(xù)加?的 Annexin V-FITC 導(dǎo)致染?失敗。

4）?1ml 4℃預(yù)冷PBS輕輕重懸細(xì)胞并計數(shù)，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。

5）再加?1ml 4℃預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。

本試劑盒將Annexin V進(jìn)?綠?熒光（FITC）標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin V作為探針，利?熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)?。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是?種核酸染料，它不能透過正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完整的細(xì)胞膜，但對凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜?使細(xì)胞核染紅。因此采?Annexin V與PI雙染的?法，就可以將處于不同凋亡時期的細(xì)胞區(qū)分開來。