（GelRed）一種穩(wěn)定、安全、靈敏的核酸熒光染料

GelRed是一種穩(wěn)定、安全、靈敏的核酸熒光染料，通過(guò)靜電及電荷相互作用結(jié)合到核酸上，可直接替代劇毒的溴化乙錠（EB），且靈敏度遠(yuǎn)高于EB，常用于瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠中dsDNA（雙鏈DNA）、ssDNA（單鏈DNA）或RNA的染色。GelRed結(jié)合單鏈DNA和RNA熒光信號(hào)約是結(jié)合雙鏈DNA的一半左右。

經(jīng)過(guò)一系列的測(cè)試，GelRed對(duì)于手套和細(xì)胞膜都是不能穿透的。在濃度遠(yuǎn)高于凝膠染色工作濃度的情況下，染料也是無(wú)細(xì)胞毒性和非誘變性的。

使用方法

GelRed可以預(yù)制到瓊脂糖凝膠中，但是GelRed可能會(huì)影響到預(yù)制膠中DNA樣品的遷移率和分辨率，因此推薦使用凝膠后染色法（泡染法）。在聚丙烯酰胺凝膠中不推薦使用預(yù)制凝膠的方法，好用泡染法。GelRed染色凝膠適用于下游的應(yīng)用，如克隆、連接和測(cè)序。通過(guò)苯-酚/氯仿抽提和醇沉淀能夠有效地將DNA中的GelRed移除。

A. 預(yù)制凝膠法

1. 常規(guī)方法準(zhǔn)備熔化的凝膠。預(yù)制膠法不適用于聚丙烯酰胺凝膠，對(duì)于聚丙烯

酰胺凝膠請(qǐng)使用泡染法。

2. 將GelRed（10,000X）原液以1:10,000比例加入到熔化的凝膠中，*混勻。

GelRed可在加熱后的凝膠冷卻至45℃左右（實(shí)驗(yàn)時(shí)不燙手為準(zhǔn)）時(shí)添加。

3. 倒膠，室溫下凝固。

4. 按常規(guī)方法上樣電泳。注：預(yù)制膠中橙色的G示蹤染料和GelRed不兼容。

5. 觀察染色凝膠使用標(biāo)準(zhǔn)的透照儀(302或312 nm)，成像使用溴化乙錠濾光器，SYBR或GelStar濾光器凝膠成像也可以得到很好的結(jié)果。

6. 未使用的含有GelRed的預(yù)制凝膠可以重新熔化做膠，為保證佳熒光信號(hào)，酌情添加適量染料。不建議長(zhǎng)期儲(chǔ)存含有GelRed熔化形式的瓊脂糖。含有GelRed的預(yù)制膠可以保存在4℃供下次使用。

B. 泡染法

1. 按照常規(guī)方法進(jìn)行凝膠電泳。

2. 稀釋 GelRed ：用水將10,000X儲(chǔ)備液稀釋3300倍制成3X染色液。通常情況下50mL染色液足夠染一小塊凝膠。

注：染色液中含有0.1 M NaCl能增強(qiáng)靈敏度，但可能會(huì)促使凝膠染色出現(xiàn)沉淀。

3. 把凝膠放于合適的容器，如聚丙烯染色托盤中。添加足量的3X染色液至浸沒(méi)凝膠。

4. 室溫緩慢振蕩染色30min。注：佳染色時(shí)間根據(jù)凝膠厚度以及瓊脂糖濃度不同略有不同。對(duì)于含3.5-10%丙烯酰胺的凝膠，染色時(shí)間通常介于30min至1h，并隨丙烯酰胺含量增加而延長(zhǎng)。

5. 不必脫色，必要的話可以水洗以降低背景值。

6. 使用標(biāo)準(zhǔn)的透照儀(302或312 nm)觀察染色凝膠，成像使用溴化乙錠濾光器，SYBR 或 GelStar濾光器凝膠成像也可以得到很好的結(jié)果。

7. 染色液可重復(fù)使用2-3次，室溫下避光保存。

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