人全血單個(gè)核細(xì)胞分離液的使用步

產(chǎn)品說(shuō)明：

本產(chǎn)品是一種用于分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞的無(wú)菌、低內(nèi)毒素水平的密度梯度分離液。外 周血中單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，其體積、形態(tài)和密度與其他細(xì)胞不同，紅細(xì)胞和粒細(xì)胞密度較大，為 1.090 g/mL 左右，淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞密度為 1.075~1.090 g/mL，血小板為 1.030~1.035 g/mL。為此利用一種密度介于 1.075～1.092 之間而近于等滲的溶液做密度梯度離心，使一定密度的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細(xì)胞加以分離。

產(chǎn)品指標(biāo)：

密度 1.077±0.001g/mL

滲透壓 290~350 mOsm/kg H2O

無(wú)菌 0.1μm 濾膜過(guò)濾。

操作步驟：

1. 取新鮮抗凝全血（EDTA、枸櫞酸鈉或肝素抗凝均可）或者去纖維蛋白血液，用等體積的全血及組織稀釋液或者 PBS 稀釋全血。

2. 在離心管中加入適量分離液（當(dāng)稀釋后血液體積小于 3mL 時(shí)，加入 3mL 分離液；大于等于3mL，加入等體積分離液。但二者的總體積不能超過(guò)離心管的三分之二，否則會(huì)影響分離效果），將稀釋后的血液平鋪到分離液液面上方，注意保持兩液面界面清晰。（可以使用巴氏德吸管吸取血液，然后將血液小心的平鋪于分離液上，因?yàn)閮烧叩拿芏炔町?，將形成明顯的分層界面。如果樣品較多加樣時(shí)間較長(zhǎng)，在離心之前出現(xiàn)紅細(xì)胞成團(tuán)下沉屬正?，F(xiàn)象。）

3. 室溫，水平轉(zhuǎn)子 500~1000g，離心 20~30min（血液的體積越大所需的離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，最佳的分離條件需摸索，離心轉(zhuǎn)速最大不

超過(guò) 1200g）。

4. 離心后將出現(xiàn)明顯的分層：最上層是稀釋的血漿層，中間是透明的分離液層，血漿與分離液之間的白膜層即為單個(gè)核細(xì)胞層，離心管底部是紅細(xì)胞與粒細(xì)胞。

5. 小心的吸取白膜層細(xì)胞到 15mL 潔凈的離心管中， 10mL PBS 或細(xì)胞洗滌液洗滌白膜層細(xì)胞。250g，離心 10min。

6. 棄上清，5mL 的 PBS 或細(xì)胞清洗液重懸細(xì)胞，250g，離心 10min。

7. 重復(fù)步驟6。

8. 棄上清，細(xì)胞重懸備用。